Биоплёнки на мясопереработке: что показали 146 проб с четырёх предприятий

Что такое устойчивость и при чём здесь биоплёнки

Антимикробная устойчивость (AMR) означает, что бактерии и другие микроорганизмы становятся устойчивыми к действию антибиотиков и других химических средств контроля. Это глобально значимая проблема: из-за неё лечение инфекций может перестать работать, а медицинские процедуры, например химиотерапия и трансплантация органов, могут стать очень опасными. Устойчивость может развиваться, когда бактерии подвергаются воздействию низких уровней антибиотиков и других химических веществ и получают возможность эволюционно приобрести устойчивость.

Бактериальные биоплёнки — это скопления липких веществ, выделяемых бактериями, которые прикрепляют бактерии друг к другу и к поверхностям окружающей среды. Они защищают бактерии от химической очистки, что может позволять им сохраняться на пищевых производствах. С точки зрения антимикробной устойчивости биоплёнки могут повышать риск её возникновения и распространения между разными бактериями. Такое распространение возможно, поскольку бактерии иногда способны обмениваться ДНК, содержащей инструкции для защиты от химических веществ. Эти инструкции называют генами антимикробной устойчивости, или ARG.

Как выбрали места и собрали пробы

Мы провели исследование, чтобы определить, какие ARG присутствуют в бактериальных биоплёнках на мясоперерабатывающих предприятиях. Для этого использовали методы, позволяющие получать большие объёмы данных о последовательностях ДНК из проб биоплёнок.

Сначала мы изучили ранее опубликованные работы, чтобы выяснить, связаны ли какие-либо виды мяса с особенно выраженной проблемой антимикробной устойчивости. Достаточных оснований сосредоточить исследование на определённом виде мяса мы не нашли. По этим же работам определили места на предприятиях, где биоплёнки наиболее вероятны: влажные, трудно очищаемые поверхности, возможно, поверхности с царапинами, в которых бактерии могут расти, и участки, контактирующие с мясным соком, который может поддерживать рост бактерий.

Затем мы разработали метод отбора проб бактериальных биоплёнок с поверхностей. Было важно стандартизировать его, чтобы пробы с разных предприятий, взятые разными людьми, можно было сопоставлять. В исследовании согласились участвовать четыре предприятия. Используя опубликованные работы и беседы с техническими руководителями предприятий, мы составили списки мест, где вероятнее всего образуются биоплёнки.

Мы отправили предприятиям списки точек отбора, подробную методику и всё необходимое оборудование. Сотрудники предприятий сами отобрали пробы и вернули их в нашу лабораторию для анализа. Всего с четырёх предприятий поступило 146 проб. Отбор проходил в течение 27 дней летом 2021 года.

Три способа анализа ДНК

После поступления проб в лабораторию из них выделили ДНК и проанализировали тремя способами. Все экстракты прошли ненаправленное секвенирование коротких фрагментов ДНК. Это означает, что мы брали ДНК, выделенную из биоплёнок, и определяли её последовательность — порядок букв A, T, G и C генетического кода — для большого числа коротких фрагментов из пробы.

Кроме того, 21 пробу исследовали на другом секвенаторе, который определяет последовательности гораздо более длинных фрагментов ДНК, чтобы проверить, даст ли это дополнительную информацию. Наконец, после секвенирования все пробы, в которых ещё оставалась ДНК, — 118 проб — проверили другим, направленным методом: количественной полимеразной цепной реакцией, qPCR.

Цель состояла в обнаружении трёх определённых генов: двух ARG и гена, общего для всех бактерий. qPCR даёт результаты иного типа, чем секвенирование: она может показать, сколько копий гена содержится в пробе и, следовательно, особенно ли много конкретного ARG в одной пробе по сравнению с другой. Первый метод — ненаправленное секвенирование коротких фрагментов — использовали для определения присутствующих ARG. Два других — секвенирование длинных фрагментов и qPCR — применяли в большей степени экспериментально, чтобы оценить их пригодность для будущих исследований.

Что нашли и как исключали фоновую ДНК

Мы получили большое число последовательностей ДНК из 144 из 146 поступивших проб; секвенирование двух проб оказалось неудачным. В среднем на одну пробу приходилось более 90 миллионов последовательностей. При поиске ARG во всех пробах в совокупности обнаружили 144 таких гена — это число случайно совпало с числом успешно исследованных проб. В 96 из 144 проб нашли хотя бы один ARG.

Обращает на себя внимание, что большой объём последовательностей ДНК получили и из некоторых отрицательных контрольных проб, например экстрактов из неиспользованных тампонов. Эти последовательности принадлежали бактериям, которые встречались и в исследуемых пробах. Вероятно, бактерии или их ДНК присутствовали в наборах ещё до отбора проб. Это известное и часто наблюдаемое явление. Благодаря строгой фильтрации данных мы смогли устранить влияние этой ДНК на результаты.

Среди ARG, обнаруженных в пробах в высоком количестве, был широкий набор ожидаемых генов. Часть из них обеспечивает устойчивость к антисептикам и чистящим средствам. Другие, вероятно, происходят от бактерий, особенно хорошо образующих биоплёнки, но их присутствие не гарантирует, что бактерия действительно устойчива к антимикробным средствам.

Обнаружение таких ARG связано с используемой нами базой данных. Хотя она обширна, в неё входят гены, которые могут обеспечивать устойчивость только при определённых условиях, только в сочетании с другими генами, а также гены, чьи основные функции не связаны с антимикробной устойчивостью. Поэтому здесь ARG понимаются в самом широком смысле; предсказать способность противостоять антибиотикам по одному лишь присутствию этих генов трудно.

С чем можно сравнить результаты

Похожих исследований, с которыми можно сопоставить наши данные, очень мало: эти методы пока не получили широкого применения. При сравнении с исследованием бактерий из куриного мяса, выполненным более старым методом, в наших биоплёнках в целом наблюдаются более низкие уровни ARG, чем в образцах бактерий из куриного мяса. Мы не можем определить, отражает ли это реальные различия между пробами или различие использованных методов.

Другие опробованные методы тоже дали результаты. Секвенирование длинных фрагментов оказалось в некоторой степени полезным: мы выявили больше случаев, когда ARG находились на одном и том же фрагменте ДНК. Это может быть важно, поскольку два ARG на одном фрагменте ДНК могут легче передаваться вместе между бактериями, чем два ARG на разных фрагментах.

Результаты qPCR были неоднозначными. Два проверяемых ARG было трудно отличить от фонового шума, хотя часть результатов для одного ARG согласовывалась с секвенированием. Использование qPCR для калибровки данных секвенирования давало разные результаты в зависимости от выбранных генов. Поэтому этот подход пока нельзя считать надёжным, но в будущем его, возможно, стоит изучить подробнее.

Общий вывод авторов

В целом мы обнаружили ARG в двух третях исследованных проб биоплёнок с предприятий, перерабатывающих и обрабатывающих четыре основных вида мяса в Великобритании: курятину, свинину, говядину и баранину. Однако, чтобы по этим данным оценить, насколько биоплёнки в действительности пополняют количество ARG в готовой продукции, потребовался бы дополнительный отбор проб. Наши экспериментальные подходы показали перспективность для дальнейшей работы.

Вопрос для своей практики

Первоисточник и изменения

Benucci M., Bryce S., Conyers C., Haynes E., Kennedy M., Lock I., Macarthur R., McGreig S., Walshaw J.; Burgess G., Collins O., Cuskin F. Antimicrobial Resistance in Biofilms Formed During Secondary Food Processing of Meat and Meat Products (FS307035). Итоговый отчёт для Food Standards Agency, март 2023. DOI: 10.46756/sci.fsa.gid407.

Полностью переведён раздел Lay Summary, страницы 3–5. Заголовок, подзаголовки и редакционные блоки добавлены нами; длинные абзацы разделены. Полный отчёт на английском — локальная копия PDF, 74 страницы. Страница публикации в FSA Research and Evidence указывает лицензию CC BY 4.0. Перевод является адаптацией; авторы и FSA не участвовали в его подготовке и не заявляли об одобрении.